L’aplicació de RT-PCR en temps real a Covid-19

Què és RT-PCR en temps real?

Afegint gens fluorescents al sistema de reacció PCR, utilitzant acumulació de senyal de fluorescència per supervisar tot el procés de PCR en temps real, i després quantificar la plantilla desconeguda a través d’una corba estàndard s’anomena tecnologia PCR quantitativa de fluorescència en temps real, també coneguda com Q en temps real. -PCR.

El principi d’amplificació de PCR és el mateix que el de l’instrument PCR ordinari, excepte que els primers que s’afegeixen durant l’amplificació de la PCR s’etiqueten amb isòtops, fluoresceïna, etc., i que els primers i les sondes fluorescents s’utilitzen per unir-se específicament a la plantilla per a l’amplificació a el mateix temps.

Els resultats amplificats es recullen i es transmeten al sistema d’anàlisi i processament per ordinador mitjançant el senyal de recollida en temps real del sistema de recollida de senyals de fluorescència per obtenir una sortida de resultats quantitativa en temps real.

RT-PCR en temps real és un dels mètodes de laboratori més utilitzats per detectar el virus COVID-19. Tot i que molts països han utilitzat RT-PCR en temps real per diagnosticar altres malalties, com el virus de l’Ebola i el virus Zika, molts necessiten suport per adaptar aquest mètode per al virus COVID-19, així com per augmentar les seves capacitats nacionals d’assaig.

Com funciona RT-PCR en temps real amb el virus COVID-19?

Es recull una mostra de les parts del cos on es reuneix el virus COVID-19, com el nas o la gola d’una persona. La mostra es tracta amb diverses solucions químiques que eliminen substàncies com proteïnes i greixos i que només extreuen l'ARN present a la mostra. Aquest ARN extret és una barreja del material genètic propi de la persona i, si està present, l’ARN del virus.

L’ARN es transcriu inversament a l’ADN mitjançant un enzim específic. A continuació, els científics afegeixen fragments breus addicionals d'ADN que són complementaris a parts específiques de l'ADN viral transcrit. Si el virus està present en una mostra, aquests fragments s’uneixen a seccions objectiu de l’ADN viral. Alguns dels fragments genètics afegits s'utilitzen per construir cadenes d'ADN durant l'amplificació, mentre que els altres s'utilitzen per construir l'ADN i afegir etiquetes marcadores a les cadenes, que s'utilitzen per detectar el virus.

A continuació, la mescla es col·loca en una màquina RT-PCR. La màquina circula per temperatures que escalfen i refreden la barreja per provocar reaccions químiques específiques que creen còpies noves i idèntiques de les seccions objectiu de l'ADN viral. El cicle es repeteix una i altra vegada per continuar copiant les seccions diana del DNA viral. Cada cicle duplica el número anterior: dos exemplars passen a ser quatre, quatre es converteixen en vuit, etc. Una configuració estàndard de RT-PCR en temps real sol passar per 35 cicles, cosa que significa que, al final del procés, es creen al voltant de 35 mil milions de còpies noves de les seccions d’ADN viral a partir de cada fil del virus present a la mostra. .

A mesura que es creen noves còpies de les seccions d’ADN viral, les etiquetes de marcador s’adhereixen a les cadenes d’ADN i després s’alliberen un colorant fluorescent, que es mesura per l’ordinador de la màquina i es presenta en temps real a la pantalla. L’ordinador rastreja la quantitat de fluorescència a la mostra després de cada cicle. Quan se supera un cert nivell de fluorescència, això confirma que el virus està present. Els científics també vigilen quants cicles es necessiten per assolir aquest nivell per tal d’estimar la gravetat de la infecció: com menys cicles, més greu és la infecció vírica.

Per què utilitzar RT-PCR en temps real?

La tècnica en temps real de RT-PCR és altament sensible i específica i pot aportar un diagnòstic fiable en menys de tres hores, tot i que els laboratoris tenen una mitjana d'entre sis i vuit hores. En comparació amb altres mètodes d’aïllament de virus disponibles, la RT-PCR en temps real és significativament més ràpida i té un potencial més baix de contaminació o errors, ja que tot el procés es pot dur a terme dins d’un tub tancat. Segueix sent el mètode més exacte disponible per a la detecció del virus COVID-19.

Tot i això, la RT-PCR en temps real no es pot utilitzar per detectar infeccions passades, cosa que és important per comprendre el desenvolupament i la propagació del virus, ja que els virus només estan presents en el cos durant un període de temps específic. Altres mètodes són necessaris per detectar, rastrejar i estudiar infeccions passades, particularment aquelles que poden haver-se desenvolupat i estès sense símptomes.